[유전체] Alignment Variant Calling (Fasta -> VCF)

< NGS 데이터 분석 >

 

1. 일반적으로 환자의 혈액 등 샘플을 채취하여 기계에 넣고 sequence를 읽어내는 과정을 Sequencing Base Calling이라고 함. 긴 서열을 쪼개서 반복하여 읽은 각 정보를 read라고 하고, 이를 조합하여 원 서열 정보를 알아냄
2. Base Calling이 끝난 데이터를 reference sequence와 비교하여 어느 위치에 변이가 있나를 알아내는 과정이 variant calling임
3. variant calling 정보를 통계적으로 처리하여 최종 변이 정보를 저장한 파일이 vcf 파일

 

 

- Alignment Variant Calling

Base calling을 완료하면 FASTA 혹은 FASTAQ 파일이 만들어짐.

이 데이터를 SAM -> BAM -> VCF 파일로 처리하는 과정이 alignment variant calling이라고 할 수 있음

 

 

1) Trimming FASTAQ for QC

sudo apt install sickle

sickle pe -t sanger -f /data/QC18010001_1.fastq.gz -r /data/QC18010001_2.fastq.gz \
       -o /data/QC18010001_1_trim.fastq -p /data/QC18010001_2_trim.fastq \
       -s single.fasq

- Trim을 할 수 있는 mutect2나 sickle을 다운 받음

- fastQC를 이용하여 trim된 데이터를 시각화 할 수 있음

  녹색 부분은 normal, 노란색은 reasonable, 붉은색은 bad 영역이라고 볼 수 있음

  trim 진행 후 read quality가 reasonable 이상 영역으로 정돈된 것을 확인할 수 있음

 

2. Indexing

- reference 파일과 sample 파일의 위치를 맞추기 위한 indexing 처리가 필요함

- bwa를 이용하여 처리할 수 있음

bwa-0.7.17/bwa index -a bwtsw /ref/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fasta  #ref. 파일

# trimed sample 파일의 ref에 대한 indexing
bwa-0.7.17/bwa aln /ref/Homo_sapiens_assembly38.fasta  \
			QC18010001_1_trim.fastq > QC18010001_1_trim.fastq.sai

 

3. Alignment 

- indexing을 통해 위치가 확인되면 그 위치에서의 염기서열을 비교 확인할 수 있는 alignment 과정을 거쳐

  확인된 정보를 sai > sam 파일에 저장하게 됨

- 파일의 용량을 줄이기 위해 같은 정보를 binary로 저장한 BAM 파일로 변환

bwa-0.7.17/bwa sampe /ref/Homo_sapiens_assembly38.fasta \
               QC18010001_1_trim.fastq.sai  QC18010001_2_trim.fastq.sai\
               QC18010001_1_trim.fastq  QC18010001_2_trim.fastq > QC18010001.sam
               
# samtools를 이용하여 bam 파일로 변환
samtools view -bS -q 23  QC18010001.sam >  QC18010001.bam

 

4. BAM file 

- 생성된 bam파일은 binary 정보를 담고 있으므로 육안으로 파악할 수 없음 -> IGV viewer를 이용하여 확인 가능

 

- reference 파일과 동일한 위치에 있는 sample 파일(bam)의 read 정보를 통해 변이를 확인할 수 있음 

 

5. Variant Calling with Filtering

- bam 파일에 있는 read를 통합하고, 중복 정보를 제거하여 통계적으로 타당한 변이 정보를 남겨 base quality를 보정

- 이렇게 해서 최종 variant calling 결과가 남게 되고, 

- 통계적으로 미미한 정보를 filtering한 결과를 VCF 파일로 저장하게 됨

- bam 파일과 vcf 파일의 정보를 비교하면 다음과 같음 

 

6. Annotation

- VCF 파일에서는 변이 정보를 확인할 수 있으나, 변이의 의미는 알 수 없음

- 변이의 성질, 기능 및 impact 정도는 snpEFF라는 툴로 확인해 볼 수 있음 (local)

- 또는 wANNOVAR나 ENSEMBL에 vcf 파일을 업로드하면 분석된 정보를 확인할 수 있음 (web)

elsenbl에 업로드하여 확인되는 변이 영역과 종류

 

wANNOVAR에 업로드하여 받게되는 분석 테이블

 

7. Quality Score

- fastQC 등을 이용하여 전체적 데이터의 퀄리티 체크

- 전체적인 sequence quality, quality score 및 감소된 duplicates를 확인할 수 있음